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肉毒梭菌及肉毒毒素检验

来源：- 浏览：588 更新时间：2011年12月02日

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肉毒梭菌（clostridium botulinum）广泛分布于自然界特别是土壤中，易于污染食品，于适宜条件下可在食品中产生很强的向神经性毒素（称肉毒毒素），能引起以神经麻痹为主要症状且病死率甚高的食物中毒（肉毒中毒）。婴儿肉毒中毒虽属感染型中毒，但中毒病因有时也与食物或餐具受肉毒梭菌污染有关。故检验食品特别是不经加热处理而直接食用的食品中有无肉毒毒素或肉毒梭菌（例如罐头等密封保存的食品），至为重要。
肉毒梭菌为专性厌氧的革兰氏阳性粗大杆菌，形成近端位的卵圆形芽胞，在疱肉菌培养基中生长时，混浊、产气、发散奇臭，有的能消化肉渣。
肉毒梭菌按其所产毒素的抗原特异性分为A、B、C、D、E、F、G等七个型，故肉毒梭菌的检验目标主要是其毒素。不论食品中的肉毒毒素检验或者肉毒梭菌的检验，均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据。
一、标准检验方法
（一）操作步骤
1. 肉毒毒素检测
液状检样可直接离心，固体或半固体检样须加适量（例如等量、倍量或5倍量、10倍量）明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后离心。取上清液进行检测。
另取一部分上清液，调pH6.2，每9份加10%胰酶（活力1:250）水溶液一份，混匀，经常轻轻搅动，37℃作用60min，进行检测。
肉毒毒素检测以小白鼠腹腔注射法为标准方法。
（1）检出试验：取上述离心上清液及其胰酶激活处理液，分别注射小白鼠2只，每只0.5ml，观察4d。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h内发病、死亡。主要症状为竖毛、四肢瘫软、呼吸困难、呼吸呈风箱式，腰部凹陷宛如峰腰，最终死于呼吸麻痹。
如遇小鼠猝死，以至症状不明显时，则可将注射液做适当稀释，重新试验。
（2）确证试验：不论上清液或其胰酶激活处理液，凡能致小鼠发病、死亡者，取样分成3份进行试验。1份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清，混匀，37℃作用30min，1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min；1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可，不做其他处理。3份混合液分别注射小白鼠各2只，每只0.5ml，观察4d，若注射加诊断血清与煮沸加热的2份混合液的小白鼠均获保护存活，而唯有注射未经其他处理的混合液的小白鼠以特有症状死亡，则可判定检样中有肉毒毒素存在，必要时进行毒力测定及定型试验。
（3）毒力测定：取已判定含有肉毒毒素的检样离心上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成50倍、500倍及5000倍的稀释液，分别注射小白鼠各2只，每只0.5ml，观察4d。根据动物死亡情况，计算检样中所含肉毒毒素的大体毒力（LD/mL或LD/g）。例如，5倍、50倍及500倍稀释致动物全部死亡，而注射5000倍稀释液的动物全部存活，则可大体判定检样上清液所含毒素的毒力为1000~10000LD/ml。
（4）定型试验：按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大体在10~1000LD/ml的范围，分别与各单型肉毒抗毒诊断血清等量混匀，37℃作用30min，各注射小白鼠2只，每只0.5ml，观察4d。同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与稀释毒素液等量混合作为对照。能保护动物免于发病、死亡的诊断血清型即为检样所含肉毒毒素的型别。
注：①未经胰酶激活处理的检样的毒素检出试验或确证试验若为阳性结果，则胰酶激
活处理液可省略毒力测定及定型试验。
②为争取时间尽快得出结果，毒素检测的各项试验与可同时进行。
③根据具体条件和可能性，定型试验可酌情先省略C、D、E、F及G型
④进行确证及定型等中和试验时，检样的稀释应参照所用肉毒诊断血清的效价。
⑤试验动物的观察可按阳性结果的出现随时结束，以缩短观察时间；唯有出现阴
性结果时，应保留充分的观察时间。
2. 肉毒梭菌检出（增菌产生毒培养试验）
取疱肉培养基3支，煮沸10~15min，做如下处理：
第1支：急速冷却，接种检样均质液1~2ml。
第2支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温10min，急速冷却。
第3支：接种检样，继续煮沸加热10min，急速冷却。
以上接种物于30℃培养5d，若无生长，可再培养10d。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同肉毒毒素检测，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。
3. 分离培养
选取经毒素检测试验证实含有毒梭菌的前述增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜的加热处理）接种卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48h。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及其周围培养基表面覆盖者特有的虹彩样（或珍珠层样）薄层，但G型菌无此现象。
根据菌落形状及菌体形态挑取可颖菌落，接种疱肉培养基，于30℃培养5d，进行毒素检测及培养特性检查确证实验。
（1）毒素检测：同肉毒毒素检测方法。
（2）培养特性检查：接种卵黄琼脂平板，分成2份，分别在35℃的需氧和厌氧条件下培养48h，观察生长情况及菌落形状。肉毒梭菌只有在厌氧条件下才能在卵黄琼脂平板上生长并形成具有上述特征的菌落，而在需氧条件下则不生长。
4. 检验程序
肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序如图14-1。
二、结果分析判定
如上所示，检样均质处理后，及时接种培养，进行增菌、产毒，同时进行毒素检测试验。毒素检测试验的结果可证明检样中有无肉毒毒素以及有何型肉毒毒素存在。见表14-1。

图14-1 肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序

报告（一）：检样含有某型肉毒毒素；报告（二）：检样含有某型肉毒梭菌；
报告（三）：由检样分离的菌株为某型肉毒梭菌
表14-1 试验结果举例与分析

例试验组别	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
	a型	生	死	死	死	死	死	死	死	死	生
	b型	死	生	死	死	死	死	死	死	死	生
	c型	死	死	生	死	死	死	死	死	死	生
诊断血清	d型	死	死	死	生	死	死	死	死	死	生
	e型	死	死	死	死	生	死	死	死	死	生
	f型	死	死	死	死	死	生	死	死	死	生
	混合型	生	生	生	生	生	生	生	死	死	生
毒素对照	死	死	死	死	死	死	死	死	死	生
毒素灭活对照	生	生	生	生	生	生	生	生	死	生

注：死：动物死亡；生：动物健存。
分析：
（1）例1~6：分别为A、B、C、D、E、F型肉毒毒素。
（2）例7：属于混合型肉毒毒素，即两个型或两个型以上。若必要，可用六个型的诊断血清配成各种组合的混合血清，再做中和试验。
（3）例8：可能是其他易热性毒素；也可能是毒力过强而抗毒素不足，可将供检液作更大的稀释，再做试验。
（4）例9：细菌性外毒素以外的毒素或毒物。
（5）例10：无毒素存在；或毒力减弱，必要时可酌性降低供检液的稀释倍数，再做试验。
上述中的全套试验，如认为没有必要时，可抽做其中的一部分。
若条件允许，也可先做混合血清中和试验及两个对照组，确定有肉毒毒素存在之后，再做各单型血清的中和试验以鉴定型别。
对增菌产毒培养物，一方面做一般的生长特征观察，同时检测肉毒毒素的产生情况。所得结果可证明检样中有无肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌存在。
为其他特殊目的而欲获纯菌，可用增菌培养物进行分离培养，对所得纯菌进行形态、培养特性等观察及毒素检测，其结果可证明所得纯菌为何型肉毒梭菌。
三、培养基
（一）疱肉培养基
成分：

牛肉浸液	1000ml
蛋白胨	30g
酵母浸膏	5g
磷酸二氢钠	5g
葡萄糖	3g
可溶性淀粉	2g
碎肉渣	适量
pH7.8

制法：称取新鲜除脂肪和筋膜的牛肉500g，加蒸馏水1000ml和1mol/L氢氧化钠溶液25ml，搅拌煮沸15min，充分冷却，除去表层脂肪，澄清，过滤，加水补足至1000ml。加入除碎肉渣外的各种成分，校正pH。
（二）卵黄琼脂培养基
成分：
1. 基础培养基：

肉浸液	1000ml
蛋白胨	15g
氯化钠	5g
琼脂	25~30g
pH7.5

2. 50%葡萄糖水溶液。
3. 50%卵黄盐水溶液。
制法：
制备基础培养基，分装每瓶100ml。121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每瓶内加入50%葡萄糖水溶液2ml和50%卵黄盐水悬液10~15ml，摇匀，倾注平板。
（三）明胶磷酸盐缓冲液
成分：

明胶	2g
磷酸二氢钠	4g
蒸馏水	1000ml
pH6.2

制法：加热溶解，校正pH，121℃高压灭菌15min。
（四）革兰氏染色液
1. 结晶紫染色液

结晶紫	1g
95%乙醇	20ml
1%草酸铵水溶液	80ml
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵混合

2. 革兰氏碘液

碘	1g
碘化钾	2g
蒸馏水	300ml

将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。

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