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小肠结肠炎耶尔森氏菌检验

来源：- 浏览：62 更新时间：2011年12月02日

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小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）广泛分布于自然界，是一种人畜共患的病原微生物，对人以肠道感染为主，并可成为各种疾病的病原。在食品和饮水等受到本菌污染时，往往可引起人的胃肠炎暴发，其症状表现与沙门氏菌食物中毒相似。检验以检出该菌为主，用生化和血清学进行鉴定。该菌生长的最适温度为22~29℃，但它可在0~4℃发育，为嗜冷性致病性细菌，因此，应特别引起注意的是，如被该菌污染的食品，虽在低温保存，但不能防止其生存和繁殖，这与其他肠道致病菌所不同。
为加强食品卫生管理，必须提高对该菌的检验技术，建立和完善检验方法，根据实际应用，对该菌检验在原国家标准方法中所发现的问题进行了试验研究后，对一些检验项目作了改进，提出了本修订方法，以代替原GB 4789.8－84。

第一节　小肠结肠炎耶尔森氏菌标准检验方法

一、检验方法
　
　　（一）操作步骤
　　1. 样品采集和处理：与沙门氏菌食物中毒采集和处理相同。
2. 增菌培养：将食品校品接种到改良磷酸盐缓冲液中，增菌液以1:10的比例混合，置4℃冰箱进行冷增菌。
3. 碱处理：取肉及其制品等的冷增菌液0.5mL与碱处理液4.5mL混合15s。
4. 分离培养：将冷增菌液和碱处理的冷增菌液分别接种CIN-I和改良y培养基，培养于26℃48h后，在CIN-I平板上挑取红色牛眼状菌落。在改良y培养基上挑取无色透明不粘稠的菌落，进行进一步鉴定。
5. 改良克氏双糖试验：将上述可疑菌落接种到改良克氏双糖管中，于26℃、24h培养，将斜面和底部皆变黄者做进一步生化鉴定。
6. 尿素酶试验和动力观察：将改良克氏双糖上的可疑培养物接种到尿素培养基上，注意接种量要大，挑取一接种环，振摇数秒钟，放置26℃培养2~4h，然后将阳性者接种两管半固体，分别放26℃和37℃温箱，培养24h检查，如在26℃有动力者，可进行镜检和进一步生化试验。
7. 染色镜检：将上述可疑菌落做涂片染色，进行显微镜观察，呈革兰氏阴性球杆菌，有时呈椭圆或杆状，大小为0.8~3.0μm×0.8ｕm者做进一步生化检验。
8. 生化试验：将上述可疑菌落做下列主要生化试验与其他相似细菌进行鉴别。
V-P试验、鸟氨酸脱羧酶试验，山梨醇、甘露醇、蔗糖、棉子糖、鼠李糖等发酵试验。
所有以上生化反应皆为26℃培养。
9. 血清学鉴定：除进行生化学鉴定外，亦可做血清型别的鉴定。目前国内可生产27种O型血清因子，供各地使用，具体操作方法与沙门氏菌O因子血清分型相同。
（二）检验程序

二、结果分析判定及注意事项

　　（一）一般培养性状
本菌为革兰氏阴性杆菌或球杆菌，普通碱性染料易于着色，偶而可见两极浓染，大小为0.8~3.0μm×0.8μm，多为单个散在，有时排列为短链状或成堆，不形成芽胞，无荚膜，有周鞭毛，但不稳定，于26℃培养物中可见周鞭毛，30℃以上易消失，26℃培养有动力，37℃培养无动力，在22~26℃普通培养基上生长的幼龄菌，球形占优势，37℃培养时或在陈旧培养物中趋向多形性。最适温度为22~29℃，能在0~4℃生长繁殖，在肠道细菌所用的培养基上都能生长，但生长速度比一般肠道细菌慢，如在SS琼脂和麦康凯琼脂培养基上24h培养后菌落极小，48h可生成圆形、光滑、湿润、扁平、半透明的菌落，初分离的菌落多为光滑型，连续培养或保存不适，可有粗糙型出现。在去氧胆酸钠琼脂上，菌体个体差异显著，主要呈明显大小不一，球杆、杆状并存，有时可见有着色不良的个体，在CIN琼脂上生长良好，菌落较大，直径可达1.5~3.5mm，菌落中心呈红色，周围有明显透明环的特点，易于观察区别。不同型的菌株，菌落大小有明显不同。在肉汤等液体培养基中生长均匀混浊，一般不形成菌膜。

图7-1　小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序

（二）样品采取和处理
采取的样品以无菌操作放灭菌容器内，应立即送检，并注意冷藏，根据样品的种类分别进行处理，固体食品如肉类及其制品等，均需用均质器打碎或用乳钵研磨后再进行增菌培养。
（三）增菌培养
为使受损伤的小肠结肠炎耶尔森氏菌得到较好的恢复和繁殖或由污染少量细菌的样品中检出，必须采用增菌的方法，根据该菌能在0~4℃生长的特点，采用4℃冷增菌，有利于耶氏菌存活和缓慢繁殖，而对大多数其他细菌不利或保持不变，特别适用于含菌量少的被检材料，同时改良磷酸盐缓冲液对本菌有一定的选择性，经冷增菌培养后，分别在7d、14d、21d时进行分离，可获得较好的检出效果，虽然增菌时间较长，但可提高检出率。
（四）碱处理
小肠结肠炎耶尔森氏菌比其他革兰氏阴性细菌生长慢，因其他细菌都能在弱选择性分离琼脂平板上生长，尤其在22~26℃情况下仍可生长较快，而耶尔森氏菌往往易被掩盖。为控制其他细菌的过多生长，采用耶尔森氏菌对弱碱性有较高低抗力的特点，将冷增菌后的样液，经弱碱液迅速处理15s，立即接种选择性平板进行分离，此方法可杀死大部分不耐碱的其他细菌，可提高小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率。必须严格掌握处理方法，不宜超过时间，以免影响检出效果。
检验乳品时不需要进行碱处理，增菌培养后可直接进行分离，尤其在细菌污染较少情况下的样品，经碱处理后有时对该菌的检出也能受到影响。
（五）分离培养
将上述冷增菌液和碱处理后的培养物分别分离CIN-1平板和改良y培养基，经26℃ 48h培养后观察，挑选可疑菌落，小肠结肠炎耶尔森氏菌在CIN-I平板上生长菌落较大，扁平，有明显的边缘，中心为深红色，周围有半透明圆环的特征，成牛眼状菌落，其他肠杆菌在此培养基上与本菌菌落形态不同，易于鉴别。在改良y琼脂平板上生长为无色透明、光滑、扁平、不粘稠的菌落。经样品分离效果比较，改良y的分离率高于麦康凯和SS培养基，因此选用了CIN-I和改良y培养基结合使用，可以达到较好的分离选择效果。
CIN琼脂（Cefsulondin-Irgasan-Novobiocin　Agar）是一种对耶氏菌选择性较强的培养基，为Schienann氏于1979年研制成功的，由于配方中Irgasan成分在我国不易购到，无法应用，经试验后改用二苯醚代替，其选择培养基的效果反应相同，因此称为“CIN-I”。
（六）改良克氏双糖试验
由上述平板上挑选可疑菌落，接种改良克氏双糖斜面进行初筛，26℃ 24h后斜面底层均变黄色（少数因不发酵或迟缓发酵蔗糖者斜面可仍为红色），硫化氢阴性和不产生气体的培养物做进一步生化试验。
利用改良克氏双糖琼脂斜面对本菌初筛，比三糖铁琼脂斜面更为可靠。因为有些细菌如变形杆菌、柠檬酸杆菌、克雷伯氏菌等，都可能产生类似耶氏菌的底层和斜面均产酸的反应，在三糖铁琼脂上有15％的细菌反应不一致，难以区分，但在改良克氏双糖上的反应与其他易于混淆的细菌反应不同，绝大部分的耶氏菌在改良克氏双糖斜面上反应一致，耶氏菌甘露醇阳性者为100％，蔗糖阳性者为98％，乳糖则为8％-15％，而变形菌对甘露醇，乳糖则为阴性，即可排除部分非耶氏菌的干扰。
（七）尿素酶和动力试验
在进行进一步筛选试验中，尿素酶反应是一项非常重要的生化试验，注意培养基制做时尿素不要高温加热，以防水解影响效果，接种细菌时菌量可适当大些，一般在2~4h培养基变红，为尿素酶阳性。
同时将此菌接种两管半固体，分别放37℃和26℃，24h后观察，小肠结肠炎耶尔森氏菌于26℃培养有动力，在37℃培养不产生动力。
（八）生化学性状
小肠结肠炎耶尔森氏菌的生化学特性较为复杂，与肠杆菌科中其他细菌相比，有许多相似之处，但由于耶氏菌的各种生物型别和血清型别的生理学特性不太相同，其某些生化学性状有时是不定的，特别是各种因素的影响，如培养条件、时间、温度的不同，能使某些细菌生化性状改变，有些细菌对醇类的反应迅速，有的迟缓或不发酵。对其地理分布，菌株来源等也有着一定关系，一般生化反应在22~30℃情况下较为稳定。
因此，必须掌握好试验要求，以免影响对结果的判定。
其生化学试验项目的选定，各个国家很不一致。本方法采用以下几项主要生化学项目，是由于增菌和初筛试验中，基本上排除了非耶氏菌属的可疑细菌，简化为属内鉴别的分型表（表7-1）。
表7-1　小肠结肠炎耶尔森氏菌与其他相似菌的生化性状鉴别

	小肠结肠炎耶尔森氏菌	中间型耶尔森氏菌	弗氏耶尔森氏菌	克氏耶尔森氏菌	假结核耶尔森氏菌	鼠疫耶尔森氏菌
动力(26℃)	＋	＋	＋	＋	＋	－
尿素酶	＋	＋	＋	＋	＋	－
v-p试验(26℃)	＋	＋	＋	－	－	－
鸟氨酸脱羧酶	＋	＋	＋	＋	－	－
蔗糖	d	＋	＋	－	－	－
棉子糖	－	＋	－	－	－	d
山梨醇	＋	＋	＋	＋	－	－
甘露醇	＋	＋	＋	＋	＋	＋
鼠李糖	－	＋	＋	－	－	＋

注：＋阳性；－阴性；d有不同生化型。
（九）血清学
小肠结肠炎耶尔森氏菌的抗原结构较为复杂，目前尚未研究清楚，其血清型主要靠菌体抗原即O抗原，至1984年Wauter等增加为57个型，现已知有84个O抗原因子和19个Ｈ抗原因子，在同一血清型的菌株中，可含两种或更多的O抗原，用病人分离的小肠结肠炎耶尔森氏菌，其血清型大部分为O：3，O：5，O：8和O：9型，某些O抗原同其他细菌有共同性，如O：9与布氏菌有交叉反应，O：12血清与沙门氏菌有交叉反应等，在流行病学调查中，血清学诊断起着较为重要的作用，但在区分致病性与非致病性上价值不大。
进行血清学试验时，可将被检菌接种于普通斜面上，于26℃培养48h，取其培养物用分型血清做玻片凝集试验，注意同时与生理盐水作对照，在三糖铁斜面上于37℃培养的细菌常为粗糙型（R型），容易产生自凝。

三、培养基

　　（一）改良磷酸缓冲液

成分：磷酸氢二钠（Na₂HpO₄）	8.23g
磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O）	1.20g
氯化钠	5g
蒸馏水	1000mL
山梨醇	20g
三号胆盐	15g

制法：将磷酸盐及氯化钠溶于蒸馏水中，再加山梨醇及胆盐，溶解后校正pH为7.6，分装试管，于121℃高压灭菌15min备用。
（二）CIN-I培养基

成分：胰胨	20g
酵母浸膏	2g
甘露醇	20g
氯化钠	1g
丙酮酸钠	2g
去氧胆酸钠	2g
硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）	0.01g
琼脂	12g
蒸馏水	950mL
pH7.4±0.1

制法：上述成分溶于蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，待冷至80℃时加入二苯醚（用95％的乙醇配成0.4％的溶液）1mL，混匀，冷至50℃左右时加入中性红（3mg/mL）10mL，结晶紫（0.1mg/mL）10mL，头孢霉素（1.5mg/mL）10mL，新生霉素（0.25mg/mL）10mL，最后不断搅拌，加入10％的氯化锶10mL，倒平皿。
（三）改良y培养基

成分：蛋白胨	15g
氯化钠	10g
乳糖	2g
草酸钠	2g
去氧胆酸钠	6g
三号胆盐	5g
丙酮酸钠	2g
孟加拉红	40mg
水解酪蛋白	5g
琼脂	17g
蒸馏水	1000ml
ph7.4±0.1

制法：将上述成分溶解于蒸馏水，121℃ 15min高压灭菌。
（四）改良克氏双糖铁琼脂

成分：蛋白胨	20g
牛肉膏	3g
酵母浸膏	3g
甘露醇	20g
葡萄糖	1g
氯化钠	5g
柠檬酸铁铵	0.5g
硫代硫酸钠	0.5g
琼脂	12g
酚红	0.025g
蒸馏水	1000mL
pH7.4

制法：除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，加热煮沸以溶化琼脂，加入0.2％酚红水溶液12.5mL摇匀，分装试管，121℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用。
（五）糖发酵培养基

成分：牛肉膏	5g
蛋白胨	10g
氯化钠	3g
磷酸氢二钠	2g
0.2％溴麝草酚蓝溶液	12mL
蒸馏水	1000mL

制法：将上述成分配好后，分装每瓶100mL，121℃高压15min灭菌，另将蔗糖、棉子粮、山梨醇、甘露醇、鼠李糖等分别配成10％溶液，同时高压灭菌，将5mL糖液加入100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。
（六）氨基酸脱羧酶试验培养基

成分：蛋白胨	5g
酵母浸膏	3g
葡萄糖	1g
蒸馏水	1000mL
1.6％溴甲酚紫乙醇溶液	1mL
L-氨基酸或DL氨基酸	0.5或1g/100mL
pH6.8

制法：除氨基酸以外，将其他成分加热溶解，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸，校正pH，对照培养基不加氨基酸，分装试管，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。
试验方法：接种培养物后于37℃培养24h观察结果，阳性者产碱，培养其呈紫色，阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色，对照管应为黄色。
（七）缓冲葡萄糖蛋白胨水（V-P试验用）

成分：磷酸氢二钾	5g
多胨	7g
葡萄糖	5g
蒸馏水	1000mL
pH7.0

制法：将上述成分溶化后校正pH，分装小试管，每管1mL，121℃高压灭菌15min。
试验方法：接种培养物于37℃培养2~4d，加入6％α-萘酚酒精溶液0.5mL和40％氢氧化钾溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果，立刻或数分钟内出现红色者为阳性反应。
（八）碱处理液
氢氧化钾0.5g，氯化钠0.5g，加入蒸馏水100mL配成0.5％氢氧化钾-氯化钠溶液。
（九）动力试验培养基

成分：蛋白胨	1g
牛肉膏	0.3g
氯化钠	0.5g
琼脂	0.35~0.4g
蒸馏水	100mL

制法：按以上成分配好，煮沸使溶解，校正pH为7.4，分装小管，121℃高压灭菌15min，起立凝固备用。
（十）尿素培养基

成分：尿素	20g
酵母浸膏	0.1g
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）	9.1g
磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）	9.5g
酚红	0.01g
蒸馏水	1000mL

制法：将上述成分于蒸馏水中溶解，校正pH为6.8±0.2，不要加热，过滤除菌，无菌分装于灭菌小试管中，每管2~3mL。

第二节　小肠结肠炎耶尔森氏菌参考检验方法

一、生物学分型法

由于小肠结肠炎耶尔森氏菌生化反应的复杂性，一些学者们根据其生化特性，曾将耶氏菌分成4~6个生物型，其中以Nilehn和Wauters的分型法使用较为广泛，并按此两种分型法，认为对人类致病的大多为2，3和4型，对动物致病的常见于5型，1型大多为对人不致病。
表7-2 　小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物型

	nilehn^*(1969)	wauters ^**(1970)
1	2	3	4	5	1	2	3	4	5
卵磷脂酶						＋	－	－	－	－
水杨素	＋	－	－	－	－
七叶苷	＋	－	－	－	－
靛基质	＋	＋	－	－	－	－	(＋)^***	－	－	－
乳糖（o-f）	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	－	－
木糖	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	－	－
硝酸盐	＋	＋	＋	＋	－	＋	＋	＋	＋	－
蕈糖	＋	＋	＋	＋	－	＋	＋	＋	＋	－
山梨醇	＋	＋	＋	＋	－
鸟氨酸	＋	＋	＋	＋	－	＋	＋	＋	＋	－
v-p	＋	＋	＋^***	＋	－
β-半乳糖苷	＋	＋	＋	＋	－	＋	＋	＋	＋	－
蔗糖	＋	＋	＋	＋	－^****
山梨糖	＋	＋	＋	＋	－^****

* Nilehn的分型，除乳糖（O-F），鸟氨酸脱羧酶，V-P，β-半乳糖苷和蔗糖为25℃外，
其余均为37℃。
** Wauters的分型，除靛基质为29℃外，其余均为25℃。
*** 29℃为阳性，37℃为迟缓阳性。
**** 对某些菌株反应可能有改变，其结果应在7天后报告。

Bergey细菌鉴定手册（1984），曾用7项生化试验，将小肠结肠炎耶尔森氏菌分为5个不同的生物型（表7-3）。
表7-3　小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物型

特　性	生　物　型
1	2	3	4	5
脂酶（吐温80）	＋	－	－	－	－
脱氧核糖核酸酶	－	－	－	＋	＋
靛基质	＋	＋	－	－	－
硝酸盐	＋	＋	＋	＋	－
木糖	＋	＋	＋	－	－
蔗糖	＋	＋	＋	＋	d
蕈糖	＋	＋	＋	＋	-

注：d不定。
菌株的生物型及其与血清型组合，对病原性传染源追踪上具有重要意义。

二、日本食品卫生微生物检查方法（摘要）

　　（一）食品中耶氏菌的检验程序
（二）检验方法
1. 分离培养：用选择性分离培养基SS琼脂、麦康凯琼脂于25℃培养3d。
2. 增菌培养：50mL食品检液加入灭菌磷酸盐缓冲液450mL中，4℃培养10天或25℃培养2d后，取0.5mL培养液，加于4.5mL的0.5％氢氧化钾-氯化钠溶液中，反应1min，再将处理液涂于SS和麦康凯琼脂平板上，25℃培养48h。
3. 确定试验：接种鉴别培养基，三糖铁琼脂和LIM（赖氨酸，吲哚，动力）培养基，35℃18~24h观察，V-P半固体培养基于25℃48h观察，动力为阳性，加V-P试剂呈明显红色反应。尿素培养基放25℃培养48h，如48h后，仍为阴性时，再继续培养。
4. 判定试验：上述鉴别培养基中可疑为耶氏菌时，进行水杨素、密二糖、棉子糖、七叶灵、鸟氨酸脱羧酶及细胞色素氧化酶各试验，以判定本菌。

表7-4　小肠结肠炎耶尔森氏菌及类似菌的主要鉴别性状

菌名

三糖铁琼脂

lim

v-p

尿素

水杨素

七叶灵

密二糖

棉子糖

鸟氨酸

细胞色素氧化酶

高层

斜面

硫化氢

气体

赖氨酸

吲哚

动力

反应

动力

小肠结肠炎耶尔森氏菌

黄

－

（）

－

＋

－

＋

－

弗氏耶尔森氏菌

黄

－

＋

－

＋

－

＋

－

中间型耶尔森氏菌

黄

－

＋

－

＋

克氏耶尔森氏菌

红

黄

－

（）

－

＋

－

假结核耶尔森氏菌

红

黄

－

＋

－

5. 血清学检查：用普通琼脂培养基于25℃培养的菌体与耶尔森氏菌O抗原诊断血清做玻片凝集试验，于30s内呈现明显凝集反应时为阳性。

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