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本方法适用于以冬虫夏草和灵芝为主的保健食品中尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷的测定。
本方法最低检出量：尿嘧啶6ng；尿苷10ng；腺嘌呤16.7ng；腺苷16.7ng。 1. 方法提要 冬虫夏草和灵芝中的尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷用50%的乙醇超声抽提后于高效液相色谱中反相分离，紫外检测以标准品的保留时间定性，以峰面积外标准定量。 2. 仪器 （1）高效液相色谱仪：BIO-RAD，1706多波长紫外检测器。 （2）超纯水装置：Milli-Q型。 （3）超声波提取器。 （4）溶剂微孔过滤器（滤膜0.45μm）。 3. 试剂 （1）甲醇：色谱纯（浙江黄岩化工实验厂）。 （2）乙醇：分析纯（广州化学试剂厂）。 （3）磷酸二氢钾：分析纯。 （4）水：三蒸水并经Milli-Q超纯处理。 （5）标准品： a. 尿嘧啶：中国科学院上海生物化学研究所。 b. 尿苷：中国科学院上海生物化学研究所。 c. 腺嘌呤：BDH英国。 d. 腺苷：中国科学院上海生物化学研究所。 （6）标准储备液：准确称取尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷各50mg分别置于50mL容量瓶中，加纯水并超声助溶，加水至刻度，混匀。 （7）单标使用液：将储备液用水稀释100倍（定性用）。 （8）混标使用液：分别准确吸取以下标准储备液（mL）于6个10mL容量瓶中，加纯水至刻度：
4. 测定步骤 （1）样品处理： a. 胶囊、片剂、颗粒冲剂等固体粉末样品：准确称取0.5g左右粉末样品置于25mL容量瓶中，加50%乙醇，于超声波提取器中超声提取30min，取出，加50%乙醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液备用。 b. 口服液或虫草鸡精等液体样品：准确吸取5mL液体样品置于25mL容量瓶中，用50%乙醇稀释，超声提取10min取出，加50%乙醇定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液备用。 （2）色谱分离条件： 色谱柱：HYPERSIL ODS 25μm 4.6mm×200m。 流动相：0.01mol/L磷酸二氢钾+甲醇（92+8）体积比。 流速：1mL/min。 测定波长：260nm。 灵敏度：0.001。 进料量：10μL。 （3）标准曲线的绘制：分别注入各种浓度的混标使用液10μL于高效液相色谱仪中，以浓度及峰面积绘制标准曲线。 线性浓度范围：尿嘧啶（1.8~18μmg/mL）；尿苷、腺嘌呤、腺苷（0.5~5.0μg/mL）。 （4）样品测定：取供色谱测定的样品溶液10μL注入高效液相色谱仪中，以标准品的保留时间定性和峰面积外标法定量。 标准品色谱图见图2-42，样品色谱图见图2-43。 5. 结果计算 式中 X——样品中核苷或碱基的含量（μg/g或μg/mL）； V——样品提取后定容的体积（mL）； c——样品测定样液中相当于标准核苷或碱基的浓度（μg/mL）； m——样品的质量（g或mL）。 6. 准确度与精密度 本法线性范围：尿嘧啶（1.8~18μmg/mL）；尿苷、腺嘌呤、腺苷（0.5~5.0μg/mL）在同一样品中用尿苷及腺苷两种浓度做加标回收率，尿苷为93.1%~96.8%；腺苷为93.8%~96.0%，相对标准偏差分别为4.0%和3.8%（n=6）。 7. 注释 （1）冬虫夏草和灵芝是我国名贵的中草药，内含活性成分很多，其中常见的核苷类化合物就有十多种，但比较有代表性的是尿苷、腺苷及其碱基。本文介绍用HPLC法对保健品中尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、腺苷的分离测定。 （2）样品中核苷及其碱基的提取有用热水浴迥流法，但此法提取较繁琐，且杂质较多，经试验用高频超声提取30min为佳，样品（液）如脂肪含量太高，可用乙醚（15mL×2）脱脂，乙醚用少量水洗，弃醚层，水层定容（或将水层蒸干，残渣用50%乙醇溶解定容至一定体积）后为样液。 （3）流动相的pH对核苷或其碱基的分离影响比较大，如尿嘧啶峰前杂质比较多可调节流动相醇水比例以排除干扰。 |
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