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反式白藜芦醇的测定方法(高效液相色谱法)
来源:-    浏览:105   更新时间:2011年12月02日
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本方法适用于葡萄酒以及其他植物和食品中反式白藜芦醇的测定。
本方法反式白藜芦醇的最低检出量为10ng/mL。
1. 方法提要
白藜芦醇(resveratrol, 3,4’,5-三羟基二苯乙烯)存在于葡萄、花生、桑葚等许多植物中,其中葡萄,尤其是葡萄皮中含量较高。目前葡萄酒中白藜芦醇的含正逐渐被作为评价酒品质的一个指标。
白藜芦醇有顺式和反式两种异构体(如下所示),在280、306nm分别有最高吸收值,植物中通常以较稳定的反式形式存在。HPLC测定葡萄酒中的白藜芦醇,酒样经前处理,用C18分析柱在306nm和280nm处分析,依据反式白藜芦醇标准在306nm处定量。



2. 试剂
(1)乙酸乙酯(CH3COOC2H5)、碳酸氢钠(NaHCO3)、无水硫酸钠(Na2SO4),以上为国产分析纯,乙腈(Fisher公司)为色谱纯,重蒸馏水。
(2)反式白藜芦醇标准品(Sigma公司,USA)。
(3)反式白藜芦醇标准储备液:准确称取5mg反式白藜芦醇标准品,用乙腈溶解后定容至10mL,混匀备用。此溶液每1mL含反式白藜芦醇0.5mg。
(4)反式白藜芦醇标准使用液:准确吸取标准储备液0.1mL,用乙腈定容至10mL,混匀备用。此溶液每1mL含反式白藜芦醇5μg。
3. 仪器
(1)高效液相色谱(HPLC)。
(2)旋转蒸发仪。
4. 测定步骤
(1)样品处理:取葡萄酒100mL,用50mL乙酸乙酯提取3次,收集提取液,用3%(体积分数)的NaHCO3溶液洗涤3次,重蒸馏水洗涤至溶液为中性,无水硫酸钠脱水,40℃下真空减压浓缩至干,残留物用5.0mL乙腈溶液,备用。
(2)色谱分离条件:
色谱柱:μ-Bondapak C-(300mm×3.9mm Waters公司出品)。
流动相:乙腈+水(40+60体积比)。
流速:0.60mL/min。
检测器波长:紫外光306nm和380nm。
柱温:室温。
进样量:20μL。
(3)标准曲线的绘制:以白藜芦醇不同浓度标准溶液进样,得到相应峰高值以浓度为横坐标,峰高为纵坐标绘制标准曲线,线性方程为y=57.69x-0.42(y:色谱峰高mm,x:白藜芦醇的浓度μg/mL),相关系数(r)为0.9998。
(4)样品测定:准确吸取处理液和标准使用液各20μL注入高效色谱仪分离测定。根据反式白藜芦醇标准品峰的保留时间定性,根据其峰面积或峰高计算样品中反式白藜芦醇的含量。
5. 结果计算



式中 X——葡萄酒中反式白藜芦醇的含量(μg/100mL);
c——标准的浓度(μg/mL);
S1——样品峰面积或峰高;
S2——标准峰面积或峰高;
V——最终体积(mL);
m——取样量(mL)。
6. 准确度与精密度
取中国红葡萄酒(北京龙徽葡萄酒公司)为样品,进行5次重复试验,其标准差为0.84,相对标准差(RSD)为3.5%。另取样品5份,分别加入20.0μg/100mL标样1.0mL,处理同前。其回收率在90.0%~97.8%之间,标准差为3.88,相对标准差(RSD)为3.1%。
7. 注释
(1)白藜芦醇具有以下主要功能:白藜芦醇能降低血脂,减少血小板的凝集,降低低密度脂蛋白的氧化,抑制环氧合酶与过氧化氢酶催化合成的产物诱导的癌症,1997年《Science》上将其列为预防和治疗癌症的最有前途的药物之一。
(2)白藜芦醇见光易分解,整个操作过程应避免阳光直射,并尽可能在暗室进行,并且应在葡萄酒开封后立刻测定,以免其中的白藜芦醇发生氧化或异构化。
(3)白藜芦醇在葡萄皮中含量较高,因而带皮发酵的红葡萄酒中含量高;仅以葡萄果汗发酵的白葡萄酒中含量低;采用葡萄原汁发酵的酒中含量高;而勾兑酒中含量微少。
(4)测定某品牌红葡萄酒中白藜芦醇,在306nm得到色谱图(图2-55)。根据标准的保留时间确定7.7min时出现反式白藜芦醇,紧随其后在8.9min时获得一个小峰。换至280nm、7.7min处的峰形变小,而8.9min处的峰形有显著增加(图2-56)。根据结构分析,顺式白藜芦醇的极性略小于反式白藜芦醇,在反相色谱中应在反式白藜芦醇的稍后出现,由此可以判断8.9min处为顺式白藜芦醇。
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