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烟酸广泛存在于食物中。它的检测方法有多种，例如：微生物法、比色法和分光光度法。其中微生物法特异性高、精密度好、操作简单、准确度高、灵敏度高，但是耗时长、必须常年保存菌种、使用的试剂较贵、操作步骤多、检测范围窄。而比色法所用时间短、操作简单，但是此种方法所用试剂毒性大、处理样品较复杂。分光光度法的优点是：所用时间短、操作简单、所用的试剂少。缺点是：试剂毒性大、时间限制严格且对样品有很严格的限制。
烟酸的结构式如下： 一、微 生 物 法 1. 原理 一种微生物生长必需某一些维生素，Lactobacillus arabinosus的生长需要烟酸。烟酸是指具有烟酸生物学活性的吡啶－3－羧酸及其衍生物的总称。它是白色晶体，是维生素中最稳定的一种，对酸、碱、热、光及弱氧化剂都很稳定，微溶于冷水，易溶于热水及乙醇。其检出限度为10ng。 2. 适用范围 本方法来源自AOAC和国际GB 12395—90。适用于食物及饲料中的烟酸的检测。 3. 仪器 （1）电热恒温培养箱（37±0.5）℃。 （2）无菌室（紫外灯消毒）。 （3）电热手提式压力蒸汽消毒器（121℃，高压30min）。 （4）液体快速混合器。 （5）离心机（3000r/min，10min）。 （6）碱式滴定管。 （7）硬质玻璃试管。 4. 试剂 所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水。 （1）标准溶液的配制： ① 烟酸标准贮备液（0.1mg/mL）：准确称取50.0mg已干燥恒重并贮于五氧化二磷干燥器中的烟酸标准，以25％乙醇液溶解并定容至500mL，于冰箱中保存。 ② 烟酸标准中间液（1μg/mL）：吸取1.00mL烟酸标准贮备液，置于100mL容量瓶中，用25％乙醇溶液定容，混匀，于冰箱中保存。 ③ 烟酸标准工作液（0.1μg/mL）：临用时吸取5.00mL烟酸标准中间液，置于50mL容量瓶中，用水定容，混匀。 （2）其他试剂的配制： ① 0.5mol/L Na2SO4：于2000mL烧杯中加入700mL水，加入28mL Na2SO4，用水稀释至1000mL。 ② 10mol/L NaOH：溶200g NaOH于水中，稀释至500mL。 ③ 0.1mol/L NaOH：取10mL 10mol/L NaOH，用水稀释至1000mL。 ④ 0.04％溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4mL 0.1mol/L NaOH研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。 ⑤ 酪蛋白（Sigma公司）：称取50g不含维生素的酪蛋白，加200mL 3mol/L HCl，121℃下水解6h，将水解物转移至蒸发皿内，在水浴上蒸发至膏状。加200mL水使之溶解后再蒸发至膏状，反复3次，以除去盐酸[注意：① 酸解酪蛋白是为了去除酪蛋白中的维生素，确保培养基中不含代测的烟酸，但酸解半不一定彻底，因此选用不含维生素的酪蛋白。② 水浴蒸发时不可蒸干或使之焦煳，若溶液被蒸干，水解液所含营养物已被破坏]。 用10mol/L NaOH调节pH至3.5，以溴酚蓝作外指示剂。加20g活性炭，振摇，过滤，反复操作至滤液无色。滤液加水稀释至500mL，加少许甲苯置冰箱中保存[注意：活性炭不能在溶液中太久，否则容易破坏酪蛋白的营养成分]。 ⑥ 溴酚蓝：称取0.1g溴酚蓝，用1＋4乙醇溶解后，再加乙醇稀释至100mL。 ⑦ 甲苯。 ⑧ 2.4mol/L HCl溶液，V＋V＝1＋4。 ⑨ 1.5mol/L生理盐水：取9g NaCl溶于100mL水中。 ⑩ 胱氨酸、色氨酸溶液：称取4g L－胱氨酸和1g L－色氨酸溶于800mL水中，加热至70～80℃，逐滴加入20％盐酸，不断搅拌，直至完全溶解为止。冷至室温，加水稀释至1000mL。加少许甲苯于冰箱中保存。 ⑾ 腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤及尿嘧啶各0.1g，加75mL水和2mL浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却，若有沉淀产生，加浓盐酸数滴，再加热。如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止。用水稀释至100mL。加少许甲苯于冰箱中保存。 ⑿ D－泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡啶醇溶液：称取D－泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇各10mg于烧杯中，以水溶解并稀释至1000mL，将此液置于棕色瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存[注意：此溶液见光分解，因此储存于棕色瓶中]。 ⒀ 0.02mol/L CH3COOH溶液：取1.18mL纯的冰醋酸，稀释至1000mL。 ⒁ 核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液：溶解1mg生物素结晶于100mL0.01747mol/L的CH3COOH中，取此液4mL（相当于40μg生物素），加入20mg核黄素和10mg盐酸硫胺素，以0.01747mol/L醋酸溶解并稀释至1000mL，将此液置于棕色瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存[注意：此溶液见光分解，因此贮存于棕色瓶中]。 ⒂ 甲盐溶液：取25g磷酸氢二钾和25g磷酸二氢钾，加水溶解后稀释至500mL，加少许甲苯于冰箱中保存。 ⒃ 乙盐溶液：取10g硫酸镁、0.5g氯化钠、0.5g硫酸亚铁和0.5g硫酸锰，加水溶解后稀释至500mL，加5滴浓盐酸，加少许甲苯于冰箱中保存。 ⒄ 乙醇溶液＝V/V＝1/3。 ⒅ 溴酚蓝：称取0.1g溴酚蓝，用1＋3乙醇溶液溶解后，再稀释至100mL。 ⒆ 0.04％溴麝香草酚蓝溶液：称取0.1g溴麝香草酚蓝于研钵中，加1.6mL，0.1mol/L NaOH，研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。 ⒇ 0.004％溴麝香草酚蓝溶液：量取100mL0.04％溴麝香草酚蓝溶液，加水稀释至1000mL，供滴定用。 21）基本培养基贮备液：
混合，加水至100mL，加热至琼脂完全溶化，以溴麝香草酚蓝为外指示剂，用盐酸趁热调pH至6.8，尽快倒入试管中，每管3～5mL，加塞棉塞，于压力蒸汽消毒器121℃灭菌10min，取出后竖直试管，冷至室温后保存于冰箱中。 （3）菌种的制备与保存： ① 菌种的制备与保存：以阿拉伯乳酸杆菌（Lactobacillus arabinosus 17－5 ATCC No.8014简称Lact.A）纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在（37±0.5）℃恒温箱中保温16～24h，取出于冰箱中保存，至多不超过2周。保存数周以上的菌种，不能立即用作制备接种液之用，一定要在使用前每天转种一次，连续2～3d，方可使用，否则生长不好。 ② 种子培养液的制备：加5mL 0.1μg/mL的烟酸标准应用液于尖头试管中，加入5mL基本培养基，塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内（高压锅）121℃下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保存数周之久。 5. 操作步骤 （1）样品制备：取含烟酸约5～50μg的均匀样品于100mL三角瓶中，加0.5mol/L H2SO4 50mL。放入高压蒸汽锅121℃下水解30min，取出，于水中冷却，用10mol/L NaOH和0.5mol/L H2SO4调pH至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。将三角瓶内的溶液转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，滤纸过滤，保存滤液于冰箱内备测（保存期不超过36h）[注意：用0.5mol/L硫酸水解，可以断开烟酸和其他物质结合的键，使烟酸游离出来。观察溴甲酚绿至草色为终点，说明溶液pH到了4.5。调pH至4.5可以除去样品中刺激和抑制细菌生长的物质，如：淀粉、脂肪酸及磷脂。许多蛋白质的等电点也在pH4.5，所以此pH也可用来沉淀蛋白质]。 （2）接种液的制备：使用前一天，将阿拉伯乳酸杆菌菌种由贮备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时制备两管，在（37±0.5）℃的恒温箱中培养16～24h。取出离心10min（3000r/min）倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10mL消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。 （3）样品标准曲线的测定：3组试管各加0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL和3.0mL工作液，每管加水稀释至5mL，再加5mL基本培养基，混匀，加棉塞。 （4）试样的测定：在试管中分别加入1、2、3、4mL样液，加水稀释至5mL，再加入5mL基本培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅（121℃）高压10min，冷至室温备用。 （5）接种和培养：每管种一滴接种液，于（37±0.5）℃恒温箱中培养72h[注：接种后用振荡器振荡混匀试管中的液体]。 （6）滴定：从恒温箱中取出后，将试管中培养液倒入50mL三角瓶中，用5mL 0.004％溴麝香草酚蓝分2次淋洗试管，洗液倒入该三解瓶中，以0.1mol/L NaOH溶液滴定，呈绿色即为终点，此时pH约6.8，绘制烟酸标准工作曲线，用测定管得到的值，在标准曲线上查到测定管内所含烟酸的量[注意：水解液的pH调至6.8是为了不同的试剂加入基本培养基时，不致改变基本培养基的pH。此乳酸菌生长的适宜pH为6.8]。 6. 计算 以烟酸标准系列的不同质量（μg）为横坐标，滴定所需0.1mol/L NaOH的体积（mL）为纵坐标，作为标准曲线。 式中 x——样品中烟酸的含量，mg/100g； ρ——每毫升样品中烟酸含量的平衡值，μg/mL； V——样品水解液定容总体积，mL； f——样品试液的稀释倍数； m——试样质量，g； 100/1000——折算成每100g样品中烟酸含量，mg。 7. 举例 取一螺旋藻样品1.004g（m），处理后定容为100mL（V），从中取1mL稀释至25mL（f），取1、2、3、4mL入试管中，加入水和培养基，高压消毒，培养，滴定，测量根据曲线分别得出4管C值为0.037、0.073、0.110、0.136，所以4管平均值为ρ＝（0.037＋0.073/2＋0.110/3＋0.136/4）/4＝0.036。代入方程式为：χ＝（ρ×V/m）×f×（100/1000）＝（0.036×100/1.004）×25×（100/1000）＝8.96（mg/100g） 因此得出每100g螺旋藻中含8.96mg烟酸。 8. 注意事项 （1）当管中烟酸的量少于0.05μg或多于0.3μg，即超过标准曲线范围时所得到的数值不能用于计算。 （2）3mol/L盐酸的配制方法：取250mL浓盐酸，加入750mL蒸馏水，共配成1L 3mol/L的盐酸。 （3）试管应先用洗衣粉清洗后，用水冲净，再放入酸缸中浸泡1d左右，捞出后再用自来水和蒸馏水清洗干净，晾干，方可再用。 二、比 色 法 1. 原理 烟酸和烟酰胺于pH＝4.5下用稀NH4OH提取，再与CNBr溶液与10％对氨基苯磺酸反应，测其比色值。 2. 适用范围 选自AOAC；适用范围：适用于药物、食物和饲料。 3. 仪器设备 （1）容量瓶，100mL。 （2）锥形瓶，250mL。 （3）电热板。 （4）高压釜（121℃，30min）。 （5）离心管，5mL。 （6）漏斗。 （7）通风橱。 （8）酸式滴定管。 比色计（药物430～450nm，谷物470nm）。 4. 试剂 所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水。 （1）烟酸标准溶液： ①烟酸标准贮备液（100μg/mL）：将50mg USP烟道参比标准（贮于P2O5干燥器中，放于暗处保存）。 ② 标准中间液Ⅰ（10μg/mL）：取少量贮备液放置至室温。用蒸馏水将10.0mL贮备液稀释至100mL。 ③ 标准工作液Ⅱ（4μmg/mL）：将恢复至室温的贮备液2.0mL用蒸馏水稀释至50mL。 （2）稀氢氧化铵溶液：5mL NH4OH用H2O稀释至250mL。 （3）稀盐酸：V＋V＝1＋5。 （4）磷酸盐缓冲液（pH＝8）：将60gNa2HPO4·7H2O和10gKH2PO4溶于蒸馏水中并稀释至200mL。 （5）溴化氰溶液（10％，通风橱中制备）：将370mL H2O温热至40℃，并加入40g CNBr。振荡至溶解冷却并稀释至400mL。溶液在冰箱保存[注意：CNBr剧毒，切勿与皮肤接触，必须在通风橱中操作]。 （6）10％对氨基苯磺酸溶液：按每次1mL将NH4OH加到20g对氨基苯磺酸和170mL蒸馏水的混合液中，直至酸溶解为止。用盐酸与蒸馏水溶液（1:1）调节pH至4.5，采用溴甲酚绿指示剂指示。稀释至200mL[注意：因为溶液有颜色会影响最后结果，所以稀释结束后溶液应几乎无色]。 （7）55％对氯基苯磺酸溶液：在55g对氨基苯磺酸中加入27mL蒸馏水和27mL NH4OH，振摇至溶解[注意：必要时加温]。用NH4OH或5NHCl调pH为7，再用蒸馏水稀释至100Ml[注意：保存在暗处]。 （8）0.5mol/L H2SO4：于2000mL烧杯中加入700mL水，加入28mL H2SO4，用水稀释至1000mL。 （9）10mol/L NaOH：溶200gNaOH于水中，稀释至500mL。 （10）盐酸。 （11）硫酸铵。 （12）氢氧化钙。 （13）对氨基苯磺酸。 5. 操作步骤 （1）样品制备： ① 药物：将药品研碎，溶于蒸馏水中，稀释定容。取10mL样品于锥形瓶中，加入10mLHCl，在电热板上加热蒸发至约2mL，冷却，加入25～50mL蒸馏水，用10mol/L NaOH或KOH溶液调节pH至2.5～4.5。过滤，弃去10mL过渡，转移至容量瓶中定容，使溶液含烟酸约4μg/mL[注意：溶液的烟酸含量应在50～200μg/mL]。 ② 非谷类食品及饲料：称取约28g样品，加入0.5mol/L H2SO4 200mL，混匀，在高压釜中121℃加热0.5h。冷却，用10mol/L NaOH调节pH至4.5，以溴甲酚绿作外指示剂，用蒸馏水稀释至250mL，过滤。取17g（NH4）2SO4于50mL容量瓶中，吸取40mL样品液，用H2O稀释定容，强力振摇。过滤，混匀，取1mL作比色测定用。如果样品中烟酸含量为16mg/1b（1b＝0.45kg）。最终液浓度3.2μg/mL。 移取40mL标准工作液Ⅱ至盛有17g（NH4）2SO4的50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，此液含烟酸3.2μg/mL[注意：加入H2SO4主要是为了去除样品中的蛋白及其他杂质，以防其对测量结果造成影响]。 ③ 谷类产品：随同样品种1试剂空白和5个浓度的工作标准液。 分别将1.5g Ca（OH）2放入7个锥形瓶中，移入0、5、10、15、20、25mL标准中间液Ⅰ和2.5g样品（含100μg烟酸），加入蒸馏水至90mL，振摇混匀。高压121℃下2h。趁热混匀，冷却至40℃，转移至100mL容量瓶中，稀释定容。 从容量瓶移50mL上清液至离心管中，冰浴15min或置于冰箱中≥2h。离心15min，吸取20mL上清液至盛有8g（NH4）2SO4和2mL磷酸盐缓冲液的离心管中。振荡溶解并温热至55～60℃。离心5min，过滤。 （2）操作程序： ①药物制剂和非谷类食物和饲料：假如10％的对氨基苯磺酸溶液，CNBr溶液，在通风橱中用酸式滴定管滴入，用标准工作液Ⅱ，如下表制备各管：
注：CNBr有毒，注意通风。 每只样品都要分别制备样品空白。 将标准和样品移入试管中，分别加入5mL蒸馏水作为标准空白和样品空白。转动试管内的液体，立即加入稀NH4OH，转动，加对氨基苯磺酸，再次旋转混合。立即加入0.5mL稀HCl，混匀，置于光电比色计上，加入对氨基苯磺酸后30s内在430nm和450nm波长之间任意波长调节仪器至0的A值（A是吸光度值）。从加入稀NH4OH开始按标准空白同样的方法处理标准溶液。立即转动管子，加CNBr溶液并再次转动混匀，在加入CNBr溶液后30s后转动管子，加入对氨基苯磺酸溶液，再转动。立即加入0.5mL蒸馏水，混匀，加塞。测量[注意：加入对氨基苯磺酸溶液后1.5min时颜色最深，保留2min，然后慢慢退色]。 将样品空白设在0，测样品溶液的A值。若标准和样品液含量大致相等，则烟酸含量与A值成正比。 ② 谷类制品：取5只试管，其中两只加入5mL标准液，两只加入5mL样品液，另一只加入5mL蒸馏水做试剂空白。于一只空白管，一只标准管和一只样品管各加10mL蒸馏水，将所有管置于冰中冰浴30min。对剩下的管按顺序加入10mL冷的CNBr，30s后加入1.0mL 55％对氨基苯磺酸溶液。 用标准空白在470nm处，调比色计为0，加入对氨基苯磺酸后12～15min读出其他各管的A值[注意：放入比色计前，试管必须冷却一致，每管必须拭干。如管呈雾状，浸于热水中片刻，测定前拭干]。 6. 计算 将扣除试剂空白的标准A对烟酸含量μg/mL做图，画出适宜的直线，从此图上求出已扣除样品空白和试剂空白后样品校正的A所对应的浓度c。 烟酸（mg）/样品（g）＝c/10ng样品 7. 注意事项 （1）CNBr溶液有毒，要注意安全。 （2）样品不同，处理方法不同，不要混淆。 （3）注意通风橱的通风。 （4）因为采用比色法测量，因此样品含有色素易干扰测定，影响测定结果的正确性。 （5）试管应先用洗衣粉清洗后，用水冲净，再放入酸缸中浸泡1d左右，捞出后再用自来水和蒸馏水清洗干净，晾干，方可再用。 |
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