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维生素D又称钙（或骨）化醇，系类固醇的衍生物，是一类关系钙、磷代谢的活性物质。自然界中以多种形式存在，如维生素D2、维生素D3、维生素D4、维生素D5、维生素D6、维生素D7等，至少有10种，但主要以维生素D2和维生素D3对动物和人类有营养意义，最为重要，其结构见图4－4。强化食品中强化的维生素D也是维生素D2或维生素D3，食物中也是主要测定维生素D2和维生素D3。由于维生素D不稳定，测定方法复杂，变异大、受影响因素多等特点，目前维生素测定方法主要采用高效液相色谱法。
1. 原理 样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离，以石油醚萃取后，用正相色谱柱提取富集，用反相色谱柱，紫外检测器定量测定。 2. 适用范围 本方法来源于GB/T 5413.9－1997，婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、维生素D、维生素E的测定。适用于食品或强化食品及饲料中的维生素D含量的测定。 3. 主要仪器 （1）高压液相色谱仪，具有可变波长的紫外检测器，数据处理系统或记录仪。 （2）旋转蒸发器。 （3）平底烧瓶：250mL。 （4）分液漏斗：500mL。 4. 试剂 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所有实验用水均指蒸馏水。 （1）异丙醇：色谱纯。 （2）2％焦性没食子酸乙醇溶液：取2g焦性没食子酸溶于100mL无水乙醇中。 （3）75％氢氧化钾溶液：取75g氢氧化钾溶于100mL水中。 （4）石油醚：沸程30~60℃。 （5）甲醇：色谱纯。 （6）正己烷：色谱纯。 （7）环己烷：色谱纯。 （8）维生素D标准溶液 维生素D2标准贮备液：含维生素D2100μg/mL的甲醇溶液。称取10mg 的维生素D2，用甲醇定溶于100mL容量瓶中。 维生素D3标准贮备液：含维生素D3100μg/mL的甲醇溶液。称取10mg的维生素D3，用甲醇定溶于100mL容量瓶中。 维生素D标准工作液，其中维生素D2、维生素D3的质量浓度均为1μg/mL。取维生素D2标准贮备液1mL，维生素D3标准贮备液1mL于100mL容量瓶中，用甲醇定容。 5. 操作步骤 （1）样品处理：准确称取10g样品，于250mL平底烧瓶中，加30mL蒸馏水。 （2）测定液的制备： ① 于上述样品溶液中加入100mL的20％没食子酸乙醇溶液，充分混匀后加50mL 75％氢氧化钾溶液，在蒸汽浴上连续回流30min后，立刻冷却到室温。 ② 将皂化液转入一500mL分液漏斗中，用100mL水分几次冲洗平底烧瓶。洗涤液并入分液漏斗中。 ③ 于上述分液漏斗中，加入100mL石油醚，盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1min。在振摇过程中，注意释放瓶内压力。静置分层，将水相放入另一500mL分液漏斗中，重复上述萃取过程2次，合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近干（绝不允许蒸干）后，用石油醚转移至10mL容量瓶中，定容。 ④ 从上述容量瓶中取7mL放入一试管中，用氮气将石油醚吹干，于试管中加1mL正已烷。 （3）测定： ① 测定液的制备： a. 仪器条件： 色谱柱：30cm×4mm，硅胶柱。 流动相：正己烷与环己烷按体积比1:1混合，并按体积分数0.8％加入异丙醇。 流速：1mL/min。 波长：265nm。 柱温：20℃。 灵敏度：0.005AU/MV。 注射体积：200μL。 b. 注射50μL维生素D标样和200μL样品溶液，根据维生素D标样保留时间收集维生素D于试管中，将试管用氮气吹干，准确加入0.2mL甲醇溶解。 ② 测定步骤： a. 仪器条件： 色谱柱：4.6mm×25cm，C18或具同等性能的色谱柱。 流动相：甲醇。 流速：1mL/min。 波长：265nm。 柱温：20℃。 灵敏度：0.005AU/MV。 注射体积：50μL。 b. 注射50μL维生素D标准溶液，注射50μL样品溶液，得到标样和样品溶液中维生素D峰面积或峰高。 6. 计算 （1） （2） 式中 X——样品中维生素D，mg/100g； m——称样量，含量，IU/100g； ρs——进样液中维生素D的浓度，μg/mL； As——进样液中维生素D的峰高（或峰面积）； Asd——标样中维生素D的峰高（或峰面积）； ρsd——标样中维生素D的浓度，μg/mL。 计算结果精确至小数点后一位。 7. 举例 如称取AD钙奶10.8g，经皂化、提取后，测得维生素D峰面积为18692，标样峰面积为24767，带入公式计算，得出AD钙奶含维生素D为398.0IU/100g。 8. 注意事项 （1）允许误差及最小检出量：同一样品的2次测定值之差不得超过2次测定平均值的10％；最小检出量为0.1国际单位。 （2）试剂焦性没食子酸容易变性，应购买近期生产的试剂。 （3）如果皂化不完全，可适当增加氢氧化钾的加入量。 |
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