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前 言
本标准方法系在参考了美国公职分析家协会分析方法手册（AOAC）公定分析方法及国外有关资料的基础上，经过系统研究而制定出来的。本方法特异性强、灵敏度高、不需特殊仪器，易于推广应用。 本标准由中华人民共和国卫生部提出。 本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草；青海省卫生防疫站和昆明医学院参加起草。 本标准主要起草人：周瑞华、杨晓莉、王光亚。 本标准由卫生部委托卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 1 范围 本标准规定了用微生物法测定食品中维生素B6的含量。 本标准适用于各类食品中维生素B6的测定。 2 原理 卡尔斯伯(Saccharomyces Carlsbrgensis)酵母菌需在有维生素B6存在的条件下才能生长，在一定条件下维生素B6的量与其生长呈正比关系。用比浊法测定该菌在样品液中生长的混浊度，与标准曲线相比较得出样品中维生素B6的含量。本方法检出限为0.1ng。 3 试剂和培养基 本实验所用的水均为蒸馏水。所用的试剂均需分析纯。 3.1 0.22mol/L硫酸溶液：取12.3mL相对密度为1.84的硫酸加水稀释至1000mL。 3.2 4mol/L、1mol/L及0.1mol/L氢氧化钠溶液。 3.3 25%(V/V)乙醇溶液。 3.4 维生素B6标准储备液(0.1mg/mL)：精确称取0.1220g经干燥恒重的盐酸吡哆醇标准品，用25%乙醇定容至1000mL。冰箱中保存。 3.5 维生素B6标准中间液(1.0μg/mL)：吸取5.00mL维生素B6标准储备液于500mL容量瓶中，用25%乙醇定容。冰箱中保存。 3.6 维生素B6标准应用液(50ng/mL)：临用时吸取5.00mL维生素B6标准中间液于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。 3.7 琼脂 3.8 吡哆醇Y培养基(Pyridoxine Y medium Difc 00951－15－2)：称取5.3g吡哆醇Y培养基，用水稀释至100mL。用时现配。 3.9 琼脂培养基：称取5.3g吡哆醇Y培养基、1.2g琼脂于烧杯中，加入维生素B6标准中间液2mL(3.5)，加水至100mL，于水浴中加热溶解，趁热尽快分装入试管中，每管3～5mL，塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min。制成的斜面培养基，于4℃冰箱内保存。 3.10 生理盐水：称取0.9g氯化钠溶解于100mL水中。每次使用前，分别倒入2～4支15mL试管中，每支约10mL，塞上棉塞于121℃高压灭菌5min，备用。 3.11 0.04%溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4mL 0.1 mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。 4 仪器和设备 4.1 实验室常用设备。 4.2 电热恒温培养箱。 4.3 压力蒸气消毒锅。 4.4 液体快速混合器。 4.5 离心机。 4.6 分光光度计。 4.7 耐热硬质玻璃试管：12mm(i.d)×160mm。 5 菌种与培养液的制备及保存 5.1 储备菌种的制备：以卡尔斯伯酵母菌纯菌种(Saccharomyces Carlsbrgensis中科院微生物所No.AS：2.1419)接入2～3支琼脂培养基管中，在30℃恒温箱中培养18～20h，取出，于冰箱中保存不超过两周。保存数周以上的储备菌种，不能立即做制备接种液用，必须在使用前每天移种一次，连续2～3次，才可使用。 5.2 种子培养液的制备：加5mL吡哆醇Y培养基及维生素B6标准应用液0.2mL(3.6)于试管中塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min，放冷，于冰箱中保存。每次制备2～4管备用。 6 操作步骤 6.1 种子液的制备：需无菌操作。用接种环从新鲜琼脂斜面培养基上取下卡尔斯伯酵母菌转种到种子培养液(5.2)中塞上棉塞，以45°倾斜度于30℃温度下培养18～20h，在1500r/min下离心5～10min，弃去上清液，用灭菌生理盐水洗菌种两次，再用灭菌盐水5mL稀释该菌种，使成混浊液，即接种液。 6.2 样品提取液的制备 称取样品0.5～10g(维生素B6含量不超过10ng)放入100mL三角瓶中，加72mL 0.22mol/L硫酸溶液，用瓷坩埚盖于瓶口，于121℃高压水解样品5h，取出冷却后，加约10mL4mol/L氢氧化钠，以滇甲酚绿作外指示剂，调节pH值至4.5(指示剂由蓝绿色变为黄绿色)。将三角瓶内容物移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，用滤纸过滤后，滤液于冰箱中保存备用(保存期不宜超过36h)。 6.3 样品试液管的制备 每支试管中分别加入0.05，0.10，0.20mL的样品提取液，每个样品需做两组，再加入5mL吡哆醇Y培养基。 6.4 标准系列管的制备 每支试管中分别加入维生素B6标准应用液0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16mL(相当于维生素B60，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0ng)，然后各加入5mL吡哆醇Y培养基。 6.5 灭菌 样品管(6.3)和标准管(6.4)混匀后，塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min。 6.6 接种和培养 待试管冷至室温后，在无菌条件下操作，用注射器在每支试管中接种一滴种子液，混匀后，于30℃温箱内培养18～20h。 6.7 测定 将培养后的标准系列管和样品管，在液体快速混合器上混匀后立即测定混浊度。用分光光度计于550nm波长下以标准系列的空白管调零点，分别读取各管的光密度值。 7 计算 以标准系列的含量(ng)为横坐标，以所对应的标准系列的光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。用样品的光密度值在标准曲线上查出每管中维生素B6含量，再折算成每毫升样品中维生素B6含量。 …………………………………(1) 式中： X－样品中维生素B6的含量，mg/100g； C－样品提取液中维生素B6的浓度，ng/mL； u－各样品测定管中维生素B6的浓度，ng/mL； V－样品提取液的定容总体积，mL； m－样品质量，g； 100/106－折算成每100g样品中维生素B6毫克数。 8 结果的重复性 同一实验室同时或连续2次测定结果相对偏差绝对值≤10%。 |
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